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MKBio PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)绿色
目录号 MX4023-100UL 售价 996.00元
规格 100μl 运输温度 冰袋运输
其他名称 PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling 保存温度 2-8℃避光保存
CAS号 N/A 有效期 1年
应用 细胞增殖和示踪研究 订购数量
产品简介:

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)


产品关键词:

PKH67;PKH26;Calcein AM钙黄绿素;PKH67;CFDA SE;In vivo cell tracking体内细胞示踪;Sigma MINI26;Phanos Technologies;


产品信息

产品名称

产品编号              

规格               

价格(元)      

PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling     

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

MX4023-100UL

100μl

996

MX4023-200UL

200μl

1946

MX4023-500UL

500μl

3886

【好消息】:应客户的要求,我司对试剂盒内的Diluent C可单独供应,产品信息如下:

产品名称

产品编号                

规格                   

价格(元)          

Diluent C for General Membrane Labeling

稀释液C(用于常规细胞膜标记)

MX4022-10ML

10ml

296

MX4022-30ML

30ml

586


产品描述

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)(PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling)是一款基于荧光探针PKH67,用于常规细胞膜标记的检测试剂盒,适用于体外细胞标记,体外细胞增殖以及长期的体内细胞跟踪研究等。


PKH67是一种专利的膜标记探针,与PKH1和PKH2相比,结构上带有更长的脂肪族碳尾,能稳定插入细胞膜脂质区域。正因具更长碳尾,内部数据连续性证明:PKH67具有比PKH2更低的细胞-细胞间转运发生。PKH67呈绿色荧光(见图1),最大激发波长为490nm,最大发射波长是502nm,与标准荧光素(Fluorescein)滤片兼容。PKH67非常适合用于细胞毒性实验,与碘化丙啶(PI,MX4205)或7-氨基放线菌素D(7-AAD,MX4215)这些细胞活力探针联合使用,或者与橙-红色荧光探针比如藻红蛋白(PE,MX4698)、红色荧光蛋白(RFP)等结合使用。根据染料稀释原理,PKH67常用于细胞增殖监测分析,包括抗原特异性的前体频率和带干细胞特性的静息/缓慢分化肿瘤细胞的鉴定。也能用于监测外泌体或脂质体吞噬,细胞-细胞膜转运、吞噬、抗原递呈,以及体内细胞运输研究。


以不分裂细胞为研究对象,通过对体外细胞膜滞留周期和体内荧光强度减弱频率的关联性分析,预测PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。这与PKH1和PKH2的体内半衰期相近,这两个探针都成功用于监测周期长达1-2个月的体内淋巴细胞和巨噬细胞运输研究,因此,PKH67适用于需要绿色荧光细胞连接染料的短-中期体内示踪研究,以及体外细胞毒性、吞噬、增殖、抗原递呈,或其它共培养实验。


稀释液C(Diluent C)是本试剂盒配套提供的一种水溶性溶液,特别设计的一种标记媒介能维持细胞活力,同时最大化染料溶解性和标记过程中的染色效率。Diluent C对哺乳动物细胞来说是等渗的,不含去污剂或有机溶剂,也不含生理盐和缓冲剂。根据细胞类型,染料标记后膜的内在化程度,标记细胞可能呈现不同的状态,从明亮,到均匀点状或斑驳状。然而,PKH67荧光在生理范围内不依赖于pH,且每个细胞的荧光强度通常不受染料位置的影响。


图1. PKH67的激发和发射光谱图


我司(懋康买球)提供三种规格的PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记),其中:

Mini Kit(CAT#:MX4023-100UL)建议用于小量或初步研究。当使用2ml染色体积(含2μM终浓度的PKH67),本试剂盒含有足量的染料用于检测25次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于5次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Midi Kit(CAT#:MX4023-200UL)适用于中量研究,比如体外细胞增殖或毒性研究。当使用2ml染色体积(含2μM终浓度的PKH67),本试剂盒含有足量的染料用于检测50次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Maxi Kit(CAT#:MX4021-500UL)适用于大量或体内研究。当使用2ml染色体积(含2μM终浓度的PKH67),本试剂盒含有足量的染料用于检测125次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。


产品包装

组分

名称

货号(规格)

MX4023-100UL     

MX4023-200UL    

MX4023-500UL     

MX4023-A     

PKH67 Dye (1×10-3M in EtOH)    

1×100μl

2×100μl

1×500μl

MX4023-B

Diluent C

1×10ml

2×30ml

2×30ml


保存与运输方法

保存:2-8?C避光保存,1年有效。其中组分A(PKH67 Dye)需严格避光,盖子保持拧紧。

运输:冰袋运输。


注意事项

  1. PKH67是以溶于乙醇的储存液形式提供,保存的过程中需避光并拧紧盖子,以防止溶液挥发引起的染料浓度提高。使用前需检查是否有结晶,若有结晶,需在37℃水浴溶晶,超声或涡旋直至完全溶解。

  2. Diluent C使用前需置于室温回温之后再配制标记用的细胞和染料工作液。Diluent C是无菌溶液,不含任何防腐剂或抗生素,使用和保存过程中都注意无菌。

  3. PKH67不能保存在Diluent C内,保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制,现配现用。

  4. 荧光染料均存在淬灭问题,操作和储存过程中需注意避光,以减缓荧光淬灭。

  5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。


操作步骤

1. 自行准备仪器和试剂(试剂盒不提供,用于常规细胞膜标记)

﹒良好分散,均匀的单细胞悬液(悬浮于组织培养基)

﹒含血清的组织培养基(完全培养基)

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培养基,或生理盐溶液(比如,DPBS或HBSS)

﹒血清,白蛋白或其他系统兼容的蛋白

﹒聚丙烯锥底离心管(4-15ml)

﹒能控温的离心机(高达1000×g)

﹒荧光分析用仪器(荧光酶标板,荧光或共聚焦显微镜,流式细胞仪)

﹒无菌层流净化罩

﹒血球计数板或自动细胞计数装置

﹒载玻片和盖玻片


2. 常规细胞膜标记

【染色流程】:

以下操作流程使用2ml最终染色体积,含2μM PKH67,以及1×107个细胞/ml。

以下所有步骤都在室温下进行(20-25℃)。

1. 取一锥底聚丙烯离心管制备2×107个细胞的单细胞悬浮液,用无血清培养基清洗细胞一次。

2. 400×g离心细胞5min,得到松散的细胞沉淀。

3. 细胞离心后,轻轻吸掉上清。注意不要移动任何细胞并且残留不超过25μl上清液。

4. 加1ml Diluent C到细胞沉淀中制备成2×细胞悬液,用枪轻轻吹匀以确保完全分散。不可涡旋和不可让细胞长期保留在Diluent C中。

5 染色前立即制备2×染色液(4μM in Diluent C):通过将4μl PKH67乙醇储存液到1ml Diluent C中,充分混匀分散所得。

6. 快速加1ml2×细胞悬液(Step 1.4)到1ml2×染色液(Step 1.5),用枪立即混匀样本。混匀后样本得到的终浓度是1×107个细胞/ml和2μM PKH67。

7. Step 1.6中的细胞/染料悬液孵育1-5min,中间定期混合。染色过程非常快,更长时间无任何益处。

8. 加入等体积(2ml)血清或其他适当蛋白溶液(比如1% BSA)终止染色,孵育1min允许结合多余的探针。

9. 20-25℃,400×g离心细胞10min,轻轻吸掉上清,确保不会移动细胞。用10ml完全培养基重悬细胞,转移到一个干净无菌的锥底聚丙烯离心管中,20-25℃,400×g离心细胞5min。然后用10ml完全培养基清洗细胞沉淀>2次,以确保完全去除未结合染料。

10. 最后一步清洗后,用10ml完全培养基重悬细胞沉淀,用来评估细胞回收,细胞活力和染色强度。离心和重悬沉淀到一理想终浓度的活细胞悬液。


染色示例(来自文献资源)

1)文献来源:Kelly DM, ten Bokum AM, O'Leary SM, O'Sullivan MP, Keane J. Bystander macrophage apoptosis after Mycobacterium tuberculosis H37Ra infection. Infect Immun. 2008;76(1):351-360. doi:10.1128/IAI.00614-07

PKH67染色目的(MKBIO):为了评估旁观者凋亡效应,靶向THP-1单核细胞用PKH67来标记,最终在荧光显微镜观察以确认标记是否成功。标记好的THP-1细胞(未感染的旁观者细胞量:0.5 × 105cells/ml),加入被H37Ra感染的THP-1巨噬细胞(感染效应细胞量:0.5 × 105cells/ml),接种到2孔的LabTek腔室玻片。效应巨噬细胞经H37Ra感染4h,之后剧烈清洗去除胞外细菌。之后与未感染的PKH67标记旁观者细胞共培养,37℃共培养24或48h。孵育后,上清液去除,细胞用2% PFA固定,然后用TUNEL TMR监测凋亡,细胞核用Hochest 33342复染。用荧光显微镜来评估绿色PKH67标记巨噬细胞的旁观凋亡效应。当某一个单细胞同时呈绿色(旁观者)和红色(凋亡),表明旁观者凋亡效应的存在。

Fig 2. Uninfected bystander apoptosis for macrophages that were in contact with infected macrophages. (A) Macrophages were infected for 4 h with M. tuberculosis strain H37Ra. Uninfected PKH67-labeled green THP-1 cells (0.5 × 105 cells/ml) were added to infected macrophages for 24 and 48 h. Adherent cells were then stained with Hoechst 33342 and with TUNEL TMR (red) to determine apoptosis levels. Superimposition of PKH67-labeled (green) bystander cell fields and TUNEL-positive (red) fields showed bystander apoptotic macrophages (orange). Nuclear staining (blue) (not shown) revealed the total number of cells per field. One representative field at a magnification of ×20 is shown. The arrows indicate apoptotic bystander macrophages. (B) Close-up of apoptotic bystander macrophage (arrow).


2)文献来源:Hellberg L, Fuchs S, Gericke C, et al. Proinflammatory stimuli enhance phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes. ScientificWorldJournal. 2011;11:2230-2236. doi:10.1100/2011/413271

PKH67染色目的(MKBIO):50ul肝素化全血用TLR-ligands和细胞因子刺激30min,之后,将1 × 106PKH67标记好的凋亡自体中性粒细胞加入全血中,置于37℃孵育。60min之后,红细胞用裂解液裂解掉,流式细胞术观察中性粒细胞内凋亡细胞的吞噬水平。

Fig 3. Phagocytosis of apoptotic neutrophils by neutrophils in whole blood. 50?μL heparinized whole blood was preincubated with the indicated stimuli for 30?min and, subsequently, 1 × 106 PKH67 stained apoptotic neutrophils were added. Phagocytosis was assessed after 60?min by using flow cytometry. (a) Effect of TLR-ligands on the phagocytosis rate. (b) Effect of various cytokines on the phagocytosis rate. Data show mean + SD from 3 independent experiments, *:P < 0.05. (c)–(f) Representative dot-plots for the quantitative assessment of ingestion of apoptotic cells by neutrophils in whole blood by using flow cytometry. (c) FSC/SSC gating of neutrophils. (d) Negative control: gated neutrophils without apoptotic cells. (e) neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils. (f) Neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils after exposure to Pam3CSK4.


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 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

 

 

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